Применение иммуногистохимии с целью установления давности наступления смерти

Статьи / От

Гаврилов Сергей Николаевич – старший преподаватель ФГБОУ ВО «ЧГУ им. И.Н. Ульянова» Медицинский факультет; Кафедра общей и клинической морфологии и судебной медицины.

Аннотация

Определение давности наступления смерти (ДНС) является одним из наиболее важных и сложных вопросов, разрешаемых судебно-медицинским экспертом.   На сегодняшний день существует множество способов определения ДНС, однако каждый из них имеет свои недостатки, что является основанием для разработки универсального и точного метода.  Совместное применение ИГХ и традиционных методов может способствовать более точному определению ДНС. Иммуногистохимия имеет ряд преимуществ, позволяющих более точно оценить давность наступления смерти по сравнению с традиционными методами, которые могут зависеть от личной точки зрения эксперта и длительности периода после смерти. Важно отметить, что результаты ИГХ могут различаться в зависимости от ДНС и используемых антител. К тому же, в процессе оценки ДНС важным является определение степени антигенной экспрессии тканей к различным маркерам.

Ключевые слова: Иммуногистохимия; Давность наступления смерти; Судебно-медицинская экспертиза;Антигены;Антитела;Экспрессия генов;Клеточные маркеры;Репаративные процессы;Гистология;Точность диагностики

The use of immunohistochemistry to establish the prescription of death

Gavrilov Sergey Nikolaevich — senior lecturer at the I.N. Ulyanov Moscow State University, Faculty of Medicine; Department of General and Clinical Morphology and Forensic Medicine.

Annotation

Determining the postmortem interval (PMI) is one of the most important and difficult issues resolved by a forensic medical expert.   To date, there are many ways to determine PMI, but each of them has its drawbacks, which is the basis for the development of a universal and accurate method.  The combined use of IHC and traditional methods can contribute to a more accurate definition of PMI. Immunohistochemistry has a number of advantages that make it possible to more accurately assess the age of death compared with traditional methods, which may depend on the personal point of view of an expert and the duration of the period after death. It is important to note that the results of IHC may vary depending on the PMI and the antibodies used. In addition, in the process of assessing PMI it is important to determine the degree of antigenic expression of tissues to various markers.

Keywords: Immunohistochemistry; Prescription of death; Forensic medical examination;Antigens;Antibodies;Gene expression;Cell markers;Reparative processes;Histology;Diagnostic accuracy

Введение

Определение давности наступления смерти (ДНС) является одним из наиболее важных и сложных вопросов, разрешаемых судебно-медицинским экспертом [1-3]. На сегодняшний день существует множество способов определения ДНС, однако каждый из них имеет свои недостатки, что является основанием для разработки универсального и точного метода.

Точность оценки ДНС снижается по мере развития посмертных изменений [4], а исследования, посвященные определению ДНС в позднем посмертном периоде ограничены. Применение методов молекулярной биологии, включающих анализ структуры деградации молекул ДНК и РНК, выполнение биохимического анализа крови, спинномозговой жидкости, стекловидного тела, проведение иммуногистохимических (ИГХ) исследований является одним из наиболее современных технологических инноваций в области судебно-медицинской экспертизы [5-7].

ИГХ методы являются одними из наиболее изученных способов определения ДНС. Mello и соавт. пришли к выводу, что ИГХ окрашивание может положительно сказаться на определении возраста в момент смерти, что связано с оценкой сохранившихся костных коллагеновых волокон и эндотелиальных клеток [8].

Материал и методы

Автором был произведен электронный поиск публикаций в базах данных PubMed/Medline, Scopus и Google Scholar. Поиск осуществлялся по следующим ключевым словам: «immunohistochemical», «time since death», «immunohistochemistry», «postmortem interval». Авторы независимо друг от друга осуществляли отбор релевантных исследований. В обзор включались исследования, опубликованные на английском языке.

Результаты и обсуждение

Количество описанных случаев в обозреваемых статьях варьировалось. Ceausu и соавт. было описано 4 случая, что являлось неменьшим показателем среди проанализированных работ [19]. Максимально число было описано Wehner и соавт. и составило 500 случаев [20]. В большинстве случаев причиной смерти являлась внезапная сердечная смерть, черепно-мозговая травма и опухолевые заболевания. ДНС варьировался от 0 часов до 45 дней [21]. Забор образцов, использованных для оценки ДНС был осуществлён из костного мозга, щитовидной железы, поджелудочной железы, сердца, кожи, десневой ткани, толстого кишечника, органов женской половой системы, скелетных мышц, лёгких и печени.

ИГХ анализ является одним из основных методов исследования трупов, особенно с длительным ДНС. Определение ДНС посредством традиционных методов, используемых в судебной медицине, несёт большую ценность в первые часы после смерти [8]. ИГХ анализ значительно облегчает идентификацию и определение ДНС трупа, что может быть использовано в уголовных расследованиях [8]. Однако, несмотря на недавние достижения в области ИГХ, опубликованных научных работ мало.
ИГХ изменения зависят от ДНС и анализируемой ткани. Результаты проведённых исследований трудно сравнивать между собой, хоть они и проводились на одних и тех же органах или тканях. Это связано с неоднородностью и применением различных маркеров антител. Анализ 16 исследований показал, что разные авторы изучали и оценивали изменения, развивающиеся по мере увеличения ДНС в 9 тканях человека, применяя при этом 18 различных маркеров антител. В большинстве публикаций, включённых в данный систематический обзор, преимущественно использовались ткани головного мозга, поджелудочной железы, сердца, щитовидной железы и десны. Рядом авторов также была изучена ткань лёгких, скелетных мышц, печени, поджелудочной железы, костного мозга, толстой кишки и матки [9-11].

Изменения окрашивания во время ИГХ прямым образом связано с увеличением ДНС и опосредовано изменением третичной структуры и денатурацией белка. Основными процессами, влияющими на протеолитические и катаболические процессы, являются увеличение ДНС и факторы внешней среды. Наиболее быстро данные процессы протекают в случаях смерти в результате сепсиса и при жарких условиях окружающей среды [12,13]. В таких случаях иммунореакция может быть отрицательной и при более ранних сроках.
Основные данные были получены из работ, проведённых Wehner и соавт., изучавшими ИГХ экспрессию с применением ГФКБ (в тканях главного мозга), тиреоглобулина и кальцитонина (в ткани щитовидной железы), инсулина, глюкагона и соматостатина (в ткани поджелудочной железы). Благодаря использованию антител против инсулина, авторам удалось определить микроскопические изменения, происходящие в поджелудочной железе в течение 45 суток после смерти [14]. Положительная иммунореакция на инсулин в бета-клетках поджелудочной железы наблюдалась во всех случаях с ДНС менее 12 дней. При ДНС более 30 дней реакция всегда была отрицательной. Исходя из этого можно предположить, что положительная иммунореакция свидетельствует о наступлении смерти в течение менее 12 дней, а отрицательная – более 29 дней [14].

Та же группа исследователей изучила ИГХ изменения в ткани щитовидной железы при использовании антител к кальцитонину и тиреоглобулину. Положительная реакция на тиреоглобулин в коллоидных и фолликулярных клетках свидетельствовала о ДНС менее 5 дней. Отрицательная иммунореакция была определена во всех образцах, давность наступления смерти которых превышала 12 дней. Следовательно, иммунореакция может быть отрицательной при ДНС более 5 дней и положительной при менее 13 дней. Применение антител против кальцитонина привело к выявлению отрицательной иммунореакции у трупов с ДНС более 12 дней и положительной при ДНС менее 4 дней [15-17].

Chandana и соавт. оценили изменения экспрессии ГФКБ, синаптофизина, нейрофиламента у 9 трупов с ДНС между 4 и 18 часами. Материалом исследований являлась нервная ткань лобной коры, мозжечка, хвостатого ядра и чёрной субстанции. В проведённом исследовании было определено, что усиление экспрессии ГФКБ и нейрофиламента в образцах чёрной субстанции связано с увеличением ДНС. Это, вероятно, связано с дофаминергией данной ткани[18].
El-Din и соавт. в исследовании образцов кожи людей и крыс продемонстрировали усиление ИГХ экспрессии HMGB1. Выраженная иммунореакция на антиген HMGB1 свидетельствовала о ДНС менее 12 часов [19].
Было выявлено увеличение ИГХ экспрессии белка p53 в коже, которое достигло максимальных значений через 6 часов после смерти [19]. Аналогичные результаты были выявлены рядом других авторов, исследовавших ткань мозга, печени, поджелудочной железы, кожи и почек кроликов [19].

Заключение

Совместное применение ИГХ и традиционных методов может способствовать более точному определению ДНС. Иммуногистохимия имеет ряд преимуществ, позволяющих более точно оценить давность наступления смерти по сравнению с традиционными методами, которые могут зависеть от личной точки зрения эксперта и длительности периода после смерти. Важно отметить, что результаты ИГХ могут различаться в зависимости от ДНС и используемых антител. К тому же, в процессе оценки ДНС важным является определение степени антигенной экспрессии тканей к различным маркерам.

Литература:

  1. Sangwan A, Singh SP, Singh P, Gupta OP, Manas A, Gupta S. Role of molecular techniques in PMI estimation: An update. J Forensic Leg Med. Vol. 2021. No. 83. P. 102251. doi:10.1016/j.jflm.2021.102251
  2. Scrivano S, Sanavio M, Tozzo P, Caenazzo L. Analysis of RNA in the estimation of post-mortem interval: a review of current evidence. Int J Legal Med. 2019. Vol. 133. No. 6. P. 1629-1640. doi:10.1007/s00414-019-02125-x
  3. Ceciliason AS, Andersson MG, Nyberg S, Sandler H. Histological quantification of decomposed human livers: a potential aid for estimation of the post-mortem interval?. Int J Legal Med. 2021. Vol. 135. No. 1. P. 253-267. doi:10.1007/s00414-020-02467-x
  4. Zissler A, Stoiber W, Steinbacher P, Geissenberger J, Monticelli FC, Pittner S. Postmortem Protein Degradation as a Tool to Estimate the PMI: A Systematic Review. Diagnostics (Basel). 2020. Vol. 10. No. 12. P. 1014. doi:10.3390/diagnostics10121014
  5. Zilg B, Bernard S, Alkass K, Berg S, Druid H. A new model for the estimation of time of death from vitreous potassium levels corrected for age and temperature. Forensic Sci Int. 2015. Vol. 254. P. 158-166. doi:10.1016/j.forsciint.2015.07.020
  6. Swain, R., Kumar, A., Sahoo, J., Lakshmy, R., Gupta, S. K., Bhardwaj, D. N., Pandey, R. M. Estimation of post-mortem interval: A comparison between cerebrospinal fluid and vitreous humour chemistry. J Forensic Leg Med. 2015. Vol. 36. P. 144-148. doi:10.1016/j.jflm.2015.09.017
  7. van den Berge M, Wiskerke D, Gerretsen RR, Tabak J, Sijen T. DNA and RNA profiling of excavated human remains with varying postmortem intervals. Int J Legal Med. 2016. Vol. 130. No. 6. P. 1471-1480. doi:10.1007/s00414-016-1438-9
  8. Mello, R. B., Silva, M. R., Alves, M. T., Evison, M. P., Guimarães, M. A., Francisco, R. A., Astolphi, R. D., Iwamura, E. S. Tissue Microarray Analysis Applied to Bone Diagenesis. Sci Rep. 2017. Vol. 7. P. 39987. doi:10.1038/srep39987
  9. Sessa, F., Varotto, E., Salerno, M., Vanin, S., Bertozzi, G., Galassi, F. M., Maglietta, F., Salerno, M., Tuccia, F., Pomara, C., Ricci, P. First report of Heleomyzidae (Diptera) recovered from the inner cavity of an intact human femur. J Forensic Leg Med. 2019. Vol. 66. P. 4-7. doi:10.1016/j.jflm.2019.05.021
  10. Ledda, C., Loreto, C., Matera, S., Massimino, N., Cannizzaro, E., Musumeci, A., Migliore, M., Fenga, C., Pomara, C., Rapisarda, V. Early effects of fluoro-edenite: correlation between IL-18 serum levels and pleural and parenchymal abnormalities. Future Oncol. 2016. Vol. 12. No. 23s. P. 59-62. doi:10.2217/fon-2016-0338
  11. Pomara C, Riezzo I, Bello S, De Carlo D, Neri M, Turillazzi E. A Pathophysiological Insight into Sepsis and Its Correlation with Postmortem Diagnosis. Mediators Inflamm. 2016. Vol. 2016. P. 4062829. doi:10.1155/2016/4062829
  12. Wehner F, Steinriede A, Martin D, Wehner HD. Two-tailed delimitation of the time of death by immunohistochemical detection of somatostatin and GFAP. Forensic Sci Med Pathol. 2006. Vol. 2. No. 4. P. 241-247. doi:10.1385/FSMP:2:4:241
  13. Mathur, A., Agrawal, Y. K. An overview of methods used for estimation of time since death. Australian Journal of Forensic Sciences. 2011. Vol. 43. No. 4. P. 275-285. doi: 10.1080/00450618.2011.568970
  14. Wehner F, Wehner HD, Schieffer MC, Subke J. Delimitation of the time of death by immunohistochemical detection of insulin in pancreatic beta-cells. Forensic Sci Int. 1999. Vol. 105. No. 3. P. 161-169. doi:10.1016/s0379-0738(99)00124-3
  15. Wehner F, Wehner HD, Subke J. Delimitation of the time of death by immunohistochemical detection of glucagon in pancreatic alpha-cells. Forensic Sci Int. 2001. Vol. 124. No. 2-3. P. 192-199. doi:10.1016/s0379-0738(01)00608-9
  16. Wehner F, Wehner HD, Subke J. Delimitation of the time of death by immunohistochemical detection of calcitonin. Forensic Sci Int. 2001. Vol. 122. No. 2-3. P. 89-94. doi:10.1016/s0379-0738(01)00467-4
  17. Wehner F, Wehner HD, Schieffer MC, Subke J. Delimitation of the time of death by immunohistochemical detection of thyroglobulin. Forensic Sci Int. 2000. Vol. 110. No. 3. P. 199-206. doi:10.1016/s0379-0738(00)00177-8
  18. Chandana R, Mythri RB, Mahadevan A, Shankar SK, Srinivas Bharath MM. Biochemical analysis of protein stability in human brain collected at different post-mortem intervals. Indian J Med Res. 2009. Vol. 129. No. 2. P. 189-199.
  19. Ahmed Alaa El-Din E, Mohamed Ahmed S, Abdallah El Shafei D, El-Sayed Mostafa H. Implication of High-mobility group box-1 and skin post mortem changes in estimation of time passed since death: Animal and human study. Leg Med. 2021. Vol. 53. P. 101949. doi:10.1016/j. Elias E., Osman K., Aziz S.M.A., Mohamed J., Mansar A.H., Ibrahim S.F. Determination of Time of Death Based on Basic Histological Stain and Immunostain Changes. J. Sains Kesihat. Malays. 2004. Vol. 2. P. 63–70

Оставьте комментарий